Establishing a safe harbor site for the introduction of genetic information in the human cells by the recombination system attP/attB

Resumen

El objetivo principal de este proyecto es generar una plataforma de carga segura dentro del genoma de células humanas, donde la información pueda ser insertada de forma específica sin la necesidad de usar nucleasas. De este modo se reduciría la posibilidad de integraciones azarosas y se aumentaría la eficiencia de integración. Para este fin, el mecanismo propuesto en la presente Tesis Doctoral combina el uso de dos recombinasas diferentes, phiC31 y Bxb1, así como de los sistemas de transposición piggyBac y Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 es una integrasa encargada de la incorporación del ADN de fagos en el hospedador durante el ciclo lisogénico. La integración se realiza mediante recombinación entre dos sitios de unión específicos, attP presente en el fago y attB localizado en el genoma del hospedador. Durante el proceso de infección el genoma del fago queda integrado en el genoma del hospedador y flanqueado por dos nuevos sitios de reconocimiento específico, attL y attR, generados a partir de la recombinación de las secuencias originales, attP y attB. En nuestro sistema, el genoma del fago es sustituido por los sitios de carga que constituirán el núcleo de la plataforma de integración. Bajo condiciones de inducción el genoma del fago puede eliminarse del sitio de integración mediante recombinación entre los sitios attL y attR, regenerándose en el proceso los sitios attB y attP originales. Esta reacción inversa la cataliza phiC31 en presencia de una proteína accesoria denominada Factor de Direccionalidad de la Recombinación (RDF, por sus siglas en inglés). El uso alternativo de phiC31 sola o en combinación con RDF, hace posible la repetición indefinida del ciclo de carga y la consiguiente incorporación al locus genómico elegido de tantos sitios de recombinación como se consideren necesarios. El ensamblaje completo de la plataforma se consigue mediante el uso coordinado y alternativo de los transposones piggyBac y Sleeping Beauty que permite en cada paso la eliminación de los fragmentos de ADN no deseados (secuencias del plásmido, elementos de selección, etc.). Una vez constituida la plataforma de carga, la recombinasa Bxb1 es la responsable de mediar la carga de la información genética deseada: marcadores, genes terapéuticos, sistema inducible o incluso rutas regulatorias completas.