Establishing a safe harbor site for the introduction of genetic information in the human cells by the recombination system attP/attB

Resum

L’objectiu principal d’aquest projecte és generar una plataforma de càrrega segura dins el genoma, en cèl·lules humanes, on la informació pugui ser inserida de manera específica i sense necessitat d’usar nucleases. D’aquesta manera es reduiria la possibilitat d’integracions degudes a l’atzar i s’augmentaria l’eficiència d’integració. Amb aquest finalitat, el mecanisme proposat en la present Tesi doctoral combina l’ús de dues recombinases diferents, phiC31 i Bxb1, així com dels transposons piggyBac i Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 és una integrasa encarregada de la incorporació de l’ADN de fags a l’hoste durant el cicle lisogènic. Aquesta integració es realitza mitjançant la recombinació entre dos llocs d’unió específics, attP present en el fag i attB localitzat en el genoma de l’hoste. Durant el procés d’infecció el genoma del fag queda integrat en el genoma de l’hoste i flanquejat per dos llocs de reconeixement específic nous, attL i attR, generats a partir de la recombinació de les seqüències originals, attP i attB. En el nostre sistema, el genoma del fag és substituït pels llocs de càrrega que constituiran el nucli de la plataforma d'integració. Sota condicions d'inducció el genoma del fag pot eliminar del lloc d'integració mitjançant recombinació entre els llocs attL i attr, regenerant-se en el procés els llocs attB i attP originals. Aquesta reacció inversa la catalitza phiC31 en presència d'una proteïna accessòria anomenada Factor de Direccionalitat de la Recombinació (RDF, per les sigles en anglès). L'ús alternatiu de phiC31 sola o en combinació amb RDF, fa possible la repetició indefinida del cicle de càrrega i la consegüent incorporació al locus genòmic triat de tants llocs de recombinació com es considerin necessaris. L'acoblament complet de la plataforma s'aconsegueix mitjançant l'ús coordinat i alternatiu dels transposons piggyBac i Sleeping Beauty que permet a cada pas l'eliminació dels fragments d'ADN no desitjats (seqüències del plàsmid, elements de selecció, etc.). Un cop constituïda la plataforma de càrrega, la recombinasa Bxb1 és emprada per a la càrrega d'informació genètica desitjada: marcadors, gens terapèutics, sistemes induïble o inclús rutes reguladores completes