Resistencia a antimicrobianos y virulencia en cepas no-clínicas de pseudomonas aeruginosa

Resumen

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista, con una gran versatilidad metabólica y extraordinaria habilidad para crecer en distintos nichos ecológicos. P. aeruginosa es uno de los mayores responsables de infecciones nosocomiales, caracterizado por su resistencia a antibióticos y su gran arsenal de factores de virulencia. Existen múltiples estudios evaluando la relación resistencia a antibióticos-virulencia en cepas clínicas; mientras que los trabajos realizados con Pseudomonas de muestras no-clínicas son nulos o incompletos. Por ello, los dos primeros objetivos de esta tesis fueron estudiar la prevalencia de Pseudomonas en muestras fecales de animales sanos y de niños y en alimentos vegetales; así como determinar su fenotipo de resistencia a agentes antipseudomónicos. La prevalencia de Pseudomonas en animales y en niños fue de 6,5 y 6,7%, respectivamente; mientras que en alimentos vegetales fue de 53,1%. De los 330 aislados obtenidos, P. putida y P. aeruginosa predominaron entre las 20 especies detectadas. El 44,8% de los aislados de Pseudomonas spp. mostró resistencia al menos a uno de los antibióticos testados, destacando aztreonam (41,5%). El fenotipo de multirresistencia se detectó en cuatro aislados (1,2%). P. aeruginosa se aisló en 6,3% de las muestras de niños, en 0,8% de animales y en 17,9% de alimentos vegetales; caracterizadas por su alto porcentaje de sensibilidad antimicrobiana (93,1%). El tercer objetivo fue tipificar molecularmente los aislados de Pseudomonas spp., observándose una alta diversidad clonal mediante PFGE. No se detectaron patrones relacionados entre cepas de distintos orígenes. En las 76 cepas de P. aeruginosa, el serotipo O:6 fue el más frecuente (38%) y también se observó una elevada diversidad clonal (70 patrones de PFGE). Entre las 55 secuencias tipo (ST) detectadas por MLST, 14 de ellas fueron nuevas, y algunos clones (como ST244, ST252, ST253, ST277, ST395 y ST1033) se repitieron entre las cepas aisladas de niños y de alimentos vegetales. Destaca la presencia de clones intercontinentales, como ST155, ST244, ST252, ST274 y ST395, entre las cepas de P. aeruginosa de los distintos orígenes. El estudio de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos también fue un objetivo. Ningún aislado presentó un fenotipo carbapenemasa; sin embargo, las cepas de P. aeruginosa mostraron un gran polimorfismo en la proteína OprD (13 patrones). Se detectó la secuencia de inserción ISPa1635 truncando el gen oprD (GenBank MH050332) en una de las cepas resistentes a imipenem. El quinto objetivo fue estudiar la presencia de factores de virulencia, la producción de biofilm, pigmentos, y la actividad elastasa en cepas de P. aeruginosa. El 80,2% de P. aeruginosa presentó el genotipo exoU-/exoS+; mientras que el genotipo exoU+/exoS-, asociado a una elevada citotoxicidad, se detectó en el 17,1%. Seis P. aeruginosa aisladas de animales sanos carecían de los genes codificantes de los efectores del Sistema de Secreción Tipo 3 y de los genes exoA y rhlC, pero ninguna de estas seis cepas amplificó el gen de la exolisina ExlA, descrito recientemente. Todas las cepas de P. aeruginosa portaban los genes lasA, lasB, aprA, rhlAB, rhlI y rhlR. Los genes lasI y lasR no amplificaron en tres cepas que pertenecían al clon ST155. Se detectaron secuencias de inserción (ISPre2, IS1411, ISPa91 y IS1394) truncando el gen lasR (GenBank MH050329, MH050330, MH050331, MG815635, respectivamente) en cuatro cepas de P. aeruginosa. La producción de biofilm, piocianina y piorrubina, así como la actividad elastasa fue superior a la cepa de referencia PAO1 en el 92, 64, 67 y 76% de las cepas de P. aeruginosa, respectivamente. El sexto objetivo fue estudiar el genoma completo de las cepas de P. aeruginosa pertenecientes al clon ST155. Se observaron distintos mecanismos de resistencia intrínsecos y alteraciones en sus bombas de expulsión activa; así como la presencia de la isla de patogenicidad del plásmido pUM505 que contiene el gen crpP, descrito recientemente Las variantes de CrpP detectadas en estas P. aeruginosa, mostraban mutaciones en las posiciones catalíticas implicadas en la inactivación del ciprofloxacino (identidad 94-99%) y una localización cromosómica. Los últimos objetivos fueron detectar y caracterizar los biosurfactantes producidos por Pseudomonas spp. El 97,3% de las cepas de P. aeruginosa y el 32% de las cepas no aeruginosa, principalmente P. putida y P. mendocina, mostraron producción de biosurfactantes mediante el método CTAB-MB agar. Los tres biosurfactantes purificados de dos P. mendocina y una P. aeruginosa mostraron actividad antimicrobiana frente a S. aureus (rango CMI: 0,21-3,38 mg/mL) y P. aeruginosa (0,11-0,42 mg/mL). Los ramnolípidos de P. aeruginosa se asociaron probablemente a la producción de RhlAB y RhlC; mientras que queda pendiente de resolver la caracterización estructural y genética de los biosurfactantes de P. mendocina. Esta tesis, aporta datos de gran importancia en epidemiología, resistencia a antibióticos y virulencia de Pseudomonas de origen no-clínico con aplicación en salud humana, salud animal y seguridad alimentaria. Y a su vez, la detección de biosurfactantes con actividad antimicrobiana constituye una importante herramienta biotecnológica de aplicación industrial y medioambiental.