Inducción de la subunidad α del factor inducible por hipoxia (hif-1 α) mediada por el factor de crecimiento del endoletivo vascular (vegf) en condiciones no hipóxicaspapel del radical superóxido en el proceso de señalización

Resumen

Introducción: Los mecanismos de señalización intracelular activados por el principal factor angiogénico conocido, el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), se han estudiado atendiendo casi exclusivamente a la capacidad de sus receptores (VEGFRs) para interaccionar directamente con quinasas intracelulares. Sin embargo, los VEGFRs pueden además interaccionar con proteínas como el complejo de la Rac1-NADPH oxidasa, con capacidad para modificar el estado redox celular. La formación de especies reactivas de oxígeno, como el radical superóxido, es un efecto demostrado del VEGF sobre la célula endotelial (CE). El significado, como señal, de este fenómeno y cómo reacciona la CE a la variación de su estado redox, están siendo intensame nte investigados. Objetivo: Analizar los mecanismos por los que el superóxido media intracelularmente la señal de los receptores del VEGF en la CE. Estudiar la regulación de los genes para el factor inducible por hipoxia 1 alfa (HIF-1alfa) y para el VEGF. Material y Métodos: Se estimularon CE procedentes de aorta bovina en cultivo primario confluente, con VEGF-A165, H2O2, hipoxantina/xantina oxidasa (XO), Cl2Co durante 1, 3, 4, 6, 8, 12 y 24 horas. Se analizaron los niveles proteicos y de ARNm d e HIF-1alfa y VEGF mediante Western blot, RT-PCR, e inmunofluorescencia. Se utilizaron MnTMPyP como antioxidante específico de superóxido y apocinina como inhibidor del complejo Rac1-NADPH oxidasa. Se empleó cicloheximida (10 mg/ml) para estudiar la estabilidad de la proteína HIF-1alfa. Para analizar la capacidad inductora del VEGF se realizaron ensayos de actividad de lucíferasa. Resultados: El VEGF y el superóxido generados por la XO incrementan la síntesis del ARNm y los niveles proteicos de HIF-1alfa y el propio VEGF producido autólogamente por la CE. Por el contrario, H2O2 no tiene efectos significativos sobre los niveles de HIF-1alfa. El incremento en los niveles proteicos de HIF-1 alfa no es debido a un bloqueo en la ruta de degradac ión, sino a incremento de la síntesis. Apocinina (1 mM) y MnTMPyP (25 ?M), bloquean el efecto del VEGF o el propio superóxido producido por la XO. Mediante ensayo de promotor con luciferasa, comprobamos la capacidad del VEGF para inducir su propio ge n y como nuevamente el superóxido es necesario en dicha inducción. Conclusiones: 1. El aumento de la síntesis del ARNm y la proteína de VEGF y HIF-1alfa inducido por VEGF está mediado por el complejo Rac1-NADPH oxidasa. 2. El superóxido generado por...