Evaluación y diseño de bacterias lácticas (BAL) de origen alimentario y de otros hospedadores como factorías celulares de producción de bacteriocinas

Resumen

Las bacterias lácticas BAL constituyen un grupo microbiano muy interesante por sus características biotecnológicas asociadas a la producción de péptidos antimicrobianos, otros péptidos bioactivos, enzimas de utilización industrial y utilización como probióticos o por su posible utilización como factorías celulares de producción de proteínas, péptidos, enzimas y otros metabolitos de interés en la industria alimentaria o como terapeúticos en medicina humana y veterinaria y en producción animal. Por ello, el trabajo realizado durante esta tesis doctoral describe en secciones diferenciadas el desarrollo y evaluación de las metodologías genéticas necesarias para la clonación, producción y expresión funcional de péptidos antimicrobianos y de sus quimeras génicas producidas por bacterias (bacteriocinas) y cuya producción se encuentra fuertemente regulada en las bacterias naturalmente productoras, para permitir su producción y expresión funcional por BAL de los géneros Lactococcus y Lactobacillus y por levaduras recombinantes derivadas de Pichia pastoris X33 y Kluyveromyces lactis GG799. Para ello, fue necesario el diseño de fusiones génicas de las bacteriocinas maduras a diversos péptidos señal PS que dirijan su procesamiento y secreción al medio extracelular y al empleo de vectores de expresión proteíca con promotores constitutivos o inducibles, que permitan una producción controlada o continua de las bacteriocinas de interés. Otro de los objetivos de esta tesis doctoral ha recaído en el diseño y utilización de genes sintéticos, responsables de la síntesis de bacteriocinas con actividad antimicrobiana declarada frente a bacterias alterantes y patógenas Gram-positivas y Gram-negativas de interés en la industria alimentaria, mediante la clonación de los genes sintéticos deducidos de la secuencia aminoacídica conocida de las bacteriocinas de interés en vectores de expresión proteíca con promotores inducibles y en la evaluación de su producción y expresión funcional por las levaduras P. pastoris X-33 y K. lactis GG799. De interés ha sido, también, la clonación, producción y expresión funcional de la bacteriocina enterocina A EntA, producida por Enterococcus faecium T136 y de elevada actividad antilisteriana, por BAL recombinantes derivadas de Lactobacillus sakei Lb790, Lb. plantarum NC8 y Lb. casei CECT475 y con elevado potencial como probióticos. Para ello, se ha procedido a la sustitución de la secuencia líder de la EntA LSentA por el péptido señal de la proteína lactocócica Usp45 PSusp y el empleo de los vectores de expresión proteíca pSIP409 y pSIP411 con promotores inducibles y el plásmido pMG36c con promotor constitutivo. Finalmente, durante la realización de esta tesis doctoral se ha procedido también a la determinación en E. faecalis DBH18, una cepa de elevado interés biotecnológico de los genes estructurales y, a veces adyacentes, que codifican las bacteriocinas enterococina V583 EntV583, enterocina L50 EntL50A y EntL50B y enterocina JS EntJSA y EntJSB