Aislamiento, identificación y actividad antimicrobiana de bacterias lácticas bacteriocinogénicas de origen marinocaracterización bioquímica y genética y producción heteróloga de las curvacinas G14 y G15 de "Lactobacillus curvatus" BCS35

Resumen

Los objetivos desarrollados en este trabajo de investigación fueron los siguientes: (i) aislamiento e identificación de bacterias lácticas (BAL) bacteriocinogénicas de origen marino; (ii) evaluación del potencial biotecnológico y la seguridad de Lactobacillus curvatus BCS35, lo que incluye la caracterización bioquímica y genética de sus bacteriocinas; (iii) desarrollo de estrategias de bioconservación del pescado fresco recién capturado a escala de laboratorio y semiindustrial utilizando BAL bacteriocinogénicas de origen marino, y (iv) producción heteróloga de las bacteriocinas producidas por Lb. curvatus BCS35 y detección y cuantificación de su producción por la bacteria láctica multibacteriocinogénica salvaje y las bacterias recombinantes bacteriocinogénicas generadas, empleando técnicas microbiológicas e inmunoquímicas. En el Capítulo III se evaluó la actividad antimicrobiana directa de 1.245 BAL de las que 197 fueron positivas. Se seleccionaron, identificaron taxonómicamente y analizaron 64 BAL y los resultados mostraron que sólo 25 cepas secretaron bacteriocinas. Un 90% de E. faecium bacteriocinogénicos amplificaron, al menos, uno de los genes estructurales de enterocinas evaluados. Además, se realizó una evaluación de la seguridad in vitro de las cepas de E. faecium. En el capítulo IV se determinó que la actividad antimicrobiana de Lb. curvatus BCS35 es debida a la producción de, al menos, dos bacteriocinas: curvacina G14 (CurG14) y curvacina G15 (CurG15), con una masa molecular de 4.460,9 y 4.362,3 Da, respectivamente. La determinación de su secuencia aminoacídica y/o nucleotídica mostró que CurG14 solo difiere de la sakacina P en un aminoácido (Tyr en lugar de His) en la posición 12 de la bacteriocina madura y CurG15 es idéntica a la sakacina X. Además se comparó su actividad antimicrobiana específica de 4 bacteriocinas de la clase IIa purificadas, y se determinó si la sustitución Tyr12/His12 en CurG14/SakP produce algún efecto en su potencia y/o especificidad antimicrobiana. Finalmente, se determinó la seguridad in vitro de Lb. curvatus BCS35. En el Capítulo V se desarrollaron estrategias de bioconservación de la pescadilla (Merluccius merluccius) y el gallo (Lepidorhombus boscii) frescos recién capturados con las cepas Lb. curvatus BCS35 y E. faecium BNM58. A escala de laboratorio, se inocularon lotes de pescado fresco con: (i) el cultivo de la BAL como cultivo protector; y/o (ii) el sobrenadante como ingrediente alimentario, y/o (iii) sobrenadante liofilizado como ingrediente alimentario liofilizado, se refrigeraron (14 días) y se realizaron análisis microbiológicos y sensoriales. A escala semiindustrial, Lb. curvatus BCS35 se desarrolló en un fermentador semiindustrial y se inocularon tres lotes con el cultivo protector y/o el ingrediente alimentario, y se refrigeraron (14 días) en la lonja de Marín. Los análisis microbiológicos mostraron que los lotes bioconservados, además de inhibir la presencia de Listeria spp., presentaban recuentos bacterianos menores que el lote control. Finalmente, un tasador oficial de pescado de la lonja concluyó que los lotes bioconservados alcanzarían un precio más alto en el mercado que los respectivos lotes control. En el Capítulo VI, quimeras génicas con el péptido señal de la Usp45 fusionado a CurG14 y CurG15 maduras se clonaron en el plásmido pNZ8048 generando plásmidos que se transformaron en Lc. lactis NZ9000, resultando en las cepas recombinantes Lc. lactis NZ9000-69 (pNUG14E) y Lc. lactis NZ9000-12 (pNUG15E), y se demostró que ambos péptidos se procesan y secretan correctamente. Se detectó y cuantificó la actividad antimicrobiana y la producción de estas bacteriocinas de las cepas recombinantes y de la cepa salvaje a distintas temperaturas. Las concentraciones de CurG14 y CurG15 en las cepas recombinantes representaron un aumento de la producción de 20 y 4 veces, respectivamente, con respecto a la máxima cuantificada para la cepa salvaje Lb. curvatus BCS35.