Caracterización, diseño y producción recombinante de bacteriocinas y otros péptidos antimicrobianos, secuenciación genómica y efecto en la microbiota de péptidos bioactivos producidos por enterococos

Resumen

El trabajo desarrollado durante la realización de esta tesis doctoral ha dado lugar a alcanzar los siguientes objetivos: 1. La identificación y caracterización de bacterias lácticas aisladas de heces de buitres leonados Gyps fulvus subesp. fulvus por su actividad antimicrobiana, genes que codifican bacteriocinas, factores potenciales de virulencia, susceptibilidad a antibióticos, genotipado por las técnicas de ERIC-PCR y MLST y caracterización bioquímica de las bacteriocinas purificadas a homogeneidad por MALDI-TOF MS, secuenciación aminoacídica N-terminal por degradación de Edman y secuenciación de novo de las bacteriocinas purificadas por MALDI TOFTOF MS. 2. La clonación y expresión de genes sintéticos que codifican las bacteriocinas de amplio espectro de acción SRCAM 602, OR-7, E-760 y L-1077 por levaduras recombinantes, derivadas de P. pastoris. 3. La utilización de técnicas de dicroísmo circular -DC- y de resonancia magnética nuclear ¿RMN- para determinar la estructura tridimensional 3D en solución de la enterocina HF, producida por E. faecium M3K31. 4. La utilización de técnicas de secuenciación de nueva generación ¿NGS- y de la plataforma de secuenciación Illumina MiSeq para la secuenciación del genoma de E. faecium M3K31, productor de la EntHF y para una mejor evaluación de su potencial probiótico. 5. El diseño, clonación y expresión en levaduras recombinantes, derivadas de P. pastoris de genes sintéticos que codifican bacteriocinas nativas, bacteriocinas híbridas y quimeras de bacteriocinas, así como de genes sintéticos que codifican péptidos antimicrobianos producidos por eucariotas -AMPs-, péptidos híbridos y quimeras de bacteriocinas-AMPs. La identificación de las bacteriocinas nativas, bacteriocinas híbridas y de quimeras de bacteriocinas, entre sí o con AMPs, en los sobrenadantes de las células productoras ha requerido la utilización de técnicas proteómicas avanzadas de MALDI-TOF MS y de MRM-ESI-LC-MS MS QTRAP. 6. La utilización de técnicas NGS y de la plataforma de secuenciación Illumina MiSeq para la secuenciación del genoma de E. faecalis DBH18, una cepa bacteriocinogénica productora de hidrolizados lácteos con elevada actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina y productora de péptidos antihipertensivos durante su desarrollo en leche desnatada de vaca y, finalmente, 7. La utilización de técnicas de amplificación y secuenciación de amplicones que codifican 16S rRNAs y de plataformas de secuenciación masiva, para evaluar el efecto de hidrolizados lácteos fermentados, derivados del desarrollo de E. faecalis DBH18 en leche desnatada de vaca -BSMH y BSMF- y de péptidos sintéticos antihipertensivos -LHLPLP y HLPLP-, en la microbiota fecal humana y en su composición de ácidos grasos de cadena corta