Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibrosis quísticaDinámica poblacional y análisis ecológico según morfotipo, crecimiento en biopelículas y frecuencia de mutación

Resumen

INTRODUCCIÓN La fibrosis quística (FQ) es la enfermedad hereditaria autosómica recesiva más frecuente en la raza caucásica y la primera causa de enfermedad pulmonar crónica en la infancia. En la población general su frecuencia es de 1 por cada 2.500 nacidos vivos, lo que significa un portador sano por cada 25 individuos. La P. aeruginosa es el patógeno con mayor incidencia y relevancia en FQ. El 60% de los pacientes están colonizados o infectados en algún momento de su vida. A partir de los 10 años de edad, supera en incidencia a S. aureus y cuando los pacientes sobrepasan los 35 años está presente en más del 80% de los casos. Existien receptores específicos para esta bacteria en las células epiteliales del árbol respiratorio, y por ello coloniza los alveolos pulmonares, el epitelio faríngeo y los senos paranasales. Al igual que ocurre en la mayoría de los patógenos bacterianos, en P. aeruginosa la virulencia es multifactorial e intervienen muchas variables que involucran tanto a la bacteria como al hospedador OBJETIVOS La colonización/infección broncopulmonar por Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (FQ) se caracteriza por una evolución desde el inicio de la colonización, donde los aislados presentan un morfotipo no mucoso, un estado de normomutación y una alta sensibilidad a los antibióticos, hasta los estadíos más crónicos en donde las cepas que se aíslan presentan morfotipo mucoso, mayores tasas de mutación y multirresistencia a los antimicrobianos. Basándonos en esta premisa, los objetivos generales que nos planteamos al inicio del presente trabajo fueron: 1.- Describir la epidemiología de los aislados de P. aeruginosa obtenidos de pacientes con FQ atendidos en la Unidad de FQ del Hospital Universitario Ramón y Cajal. 2.- Analizar la dinámica de colonización y las ventajas ecológicas de una colección representativa de aislados de P. aeruginosa de pacientes con FQ en función del morfotipo, frecuencia de mutación, sensibilidad a los antimicrobianos y tipo de crecimiento. Los objetivos secundarios que se abordaron fueron: 1.-Comparar la epidemiología de la colonización broncopulmonar por P. aeruginosa en los pacientes con FQ atendidos en nuestra Unidad en dos periodos separados en el tiempo (1993-1995 y 2002-2003). El último periodo es previo a la implantación de nuevas medidas de manejo de estos pacientes, administración de azitromicina oral, suero salino hipertónico inhalado o ampicilina inhalada. 2.-Estudiar la estructura poblacional en una colección representativa (n=42) de cepas de P. aeruginosa de individuos con FQ. 3.-Determinar la sensibilidad antibiótica y la frecuencia de mutación en la colección representativa de cepas de P. aeruginosa. 4.-Analizar las posibles diferencias y ventajas ecológicas según el tipo de crecimiento (biopelícula o planctónico), morfotipo (mucoso o no mucoso) y frecuencia de mutación (hipomutador, normomutador e hipermutador). 5.-Conocer la concentración que previene la aparición de mutantes (CPM) y las mutaciones en concentraciones sub-CPM que confieren resistencia a los antibióticos habitualmente utilizados en pacientes con FQ. 6.-Comprender la dinámica de crecimiento y de competición de P. aeruginosa, según su morfotipo y frecuencia de mutación, las cepas utilizadas fueron, las cepas clínicas (JM7 y JM105) y las cepas de laboratorio (PAO1 y PAO¿mutS) las cuales son isogénicas entre sí. 7.-Determinar la respuesta del sistema inmune innato frente a P. aeruginosa (JM7 y JM105) obtenidas en pacientes con FQ con diferentes frecuencias de mutación. CONCLUSIONES 1. El estudio epidemiológico ha evidenciado una mayor edad de los paciente atendidos por nuestra Unidad de fibrosis quística (FQ) en el último periodo analizado, lo que reflejaría un incremento de la vida media de los pacientes. Se observa una menor colonización por Pseudomonas aeruginosa en los pacientes de memor edad. Asimismo, se ha producido un aumento de la resistencia a amikacina y una disminución de la resistencia a ciprofloxacino, posiblemente debido a los cambios en las pautas de tratamiento. 2. En las cepas de P. aeruginosa de los pacientes con FQ de nuestra Unidad existe una elevada diversidad genética, sugiriendo una adquisición independiente y/o escasa transmisión de cepas entre pacientes. 3. En los aislados analizados, no existe relación entre los clones de FQ y los clones multirresistentes causantes de infección en los hospitales españoles. En nuestros pacientes tampoco se han detectado los clones internacionales previamente relacionados con FQ, a excepción de ST16 detectado en un solo paciente (paciente 6) y que se corresponde con un ¿doble locus variant¿ del clon holandés ST497. 4. En un paciente (paciente 1) con frecuentes exacerbaciones y tratamientos antibióticos se demostró la evolución ¿in vivo¿ por deriva génica de ST242¿ST996 tras dos mutaciones nucleotídicas en el gen mutL, una de ellas no sinónima. Junto con esta evolución, se incrementó la frecuencia de mutación. 5. La frecuencia de mutación de las cepas estudiadas se incrementa con el tiempo de colonización, sin embargo existe una tendencia significativa hacia valores de normomutación cuando estos aislados crecen en biopelículas. 6. Se han constatado discrepancias en los valores de CMI según la metodología utilizada. También se han detectado considerables diferencias según el tipo de inóculo utilizado, siendo superiores los valores con un inóculo en biopelícula, a excepción de la azitromicina. 7. La determinación de los valores de CPM ha permitido conocer que las cepas hipermutadoras precisan una concentración más alta de antibiótico para prevenir la aparición de mutantes que en las normo/hipomutadoras. 8. La sobreexpresión de las bombas en mutante a concentraciones sub-CPM contribuyen de manera importante en la resistencia a las quinolonas en las cepas de FQ, pudiendo aparecer solas o en combinación con mutacines en gyrA. 9. Los ensayos de crecimiento en competición de cepas control y aislados clínicos, demostraron que las cepas hipermutadoras y mucosas no tienen ventajas frente a sus isogénicas normomutadoras y no mucosas, salvo en presencia de antimicrobianos. 10. Se produce una mayor tendencia a producir un estado inflamatorio en el sistema inmune innato por las cepas hipermutadoras/mucosas frente a las normomutadoras/no mucosas. Igualmente, la respuesta inflamatoria es considerablemente menor cuando se utiliza un inóculo en biopelícula en vez de en planctónico. 11. Existe una evolución de las cepas de P. aeruginosa normomutadoras, sensibles a los antibióticos y no mucosas detectadas en los inicios de la enfermedad hacia cepas hipermutadoras, resistentes y mucosas. Esta evolución sería el resultado de la interacción del microorganismo y el sistema inmune del paciente, así como de los múltiples tratamientos antibióticos.