Estructura y fragmentación del ADN de espermatozoides humanosrelación con infertilidad masculina

Resumen

En esta Tesis Doctoral se presenta una nueva técnica, el test de la Dispersión de la Cromatina en Espermatozoides (SCD), como una técnica novedosa para determinar la fragmentación del ADN es espermatozoides. El principio de esta técnica se basa en que los espermatozoides con ADN fragmentado no forman un halo de descondensación del ADN, característico de espermatozoides con el ADN intacto. Los halos corresponden a bucles de ADN descompactados, anclados a una estructura nuclear residual. Estos núcleos desproteinizados se denominan #nucleoides#. Para realizar esta técnica los espermatozoides intactos se incluyen en una matriz de agarosa sobre un portaobjetos, se tratan con una solución ácida para desnaturalizar las roturas de ADN, y posteriormente se lisan para eliminar membranas y proteínas. La matriz de agarosa permite trabajar con espermatozoides sin fijar sobre un portaobjetos en unas condiciones similares a una suspensión. La eliminación de proteínas nucleares genera nucleoides con un core central y un halo de bucles de ADN disperso. Utilizando tinciones fluorescentes, vemos que los espermatozoides con el ADN fragmentado no producen halos de dispersión del ADN o éstos son de tamaño muy pequeño, mientras que aquellos espermatozoides con el ADN intacto forman halos de dispersión del ADN. Estos resultados se confirmaron mediante el DBD-FISH (DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization). Por lo tanto, con esta técnica podemos detectar y cuantificar el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado presentes en una muestra seminal de forma precisa determinando el tamaño del halo. Esta técnica se denomina SCD (Sperm Chromatin Dispersion test), y se caracteriza por ser sencilla, precisa, altamente reproducible y económica para determinar la fragmentación del ADN de espermatozoides. Los nucleoides pueden ser teñidos para microscopía de campo claro, o utilizar fluorescencia. Posteriormente la técnica inicial se mejoró para la mejor visualización de la preparación utilizando un microscopio convencional de campo claro y la identificación segura de células espermáticas. Esto se consiguió al suavizar los tratamientos logrando mantener la presencia de la cola de los espermatozoides y poder así discriminar con facilidad otros tipos celulares. El resultado de este trabajo llevó a la elaboración de un kit comercial, Halosperm® (Halotech DNA SL, Madrid). Una vez demostrada la fiabilidad de la técnica, se procedió a comprobar la relevancia clínica de la fragmentación del ADN de los espermatozoides en los procesos de Reproducción Asistida y comprobar su implicación en el desarrollo y calidad embrionarios. Se comprobó que los niveles de fragmentación del ADN de espermatozoides, analizados mediante el test SCD, se correlacionan negativamente con la tasa de fecundación y la calidad embrionaria en ciclos de FIV/ICSI. Además, La determinación de la fragmentación del ADN podría ser de especial interés en caso de pacientes con una tasa baja de gestación y baja calidad embrionaria, ya que el daño en el ADN podría ser un factor causal en estos casos. También se realizó un estudio sobre la estructura de los lugares sensibles al álcali en el ADN de espermatozoides empleando sistemas enzimáticos con marcaje in situ, y las diferencias existentes en el daño basal de los espermatozoides en comparación con células somáticas. La técnica DBD-FISH demuestra que el ADN desproteinizado de los espermatozoides humanos posee una extrema sensibilidad a la desnaturalización alcalina, en comparación con el ADN de los leucocitos. Esto se debe a la presencia de una alta densidad de lugares lábiles alcalinos constitutivos. La digestión con nucleasa mung bean reveló una mayor densidad de segmentos de cadena sencilla en el ADN de los espermatozoides humanos, en relación con el de leucocitos. Posiblemente son áreas de desnaturalización parcial, que podrían corresponder a los lugares lábiles alcalinos constitutivos.