Análisis genómico de Enterobacterales productores de carbapenemasas de interés clínico en el Hospital Universitario 12 de Octubre.

Resumen

La emergencia y la diseminación de las especies de Enterobacterales productoras de carbapenemasas (EPC) es un problema de Salud Pública que se ha convertido en una prioridad asistencial. La resistencia a los carbapenémicos ha supuesto un gran reto para los clínicos y los profesionales encargados de la vigilancia y control de las infecciones, debido a las limitaciones en los tratamientos terapéuticos. El principal mecanismo de resistencia a carbapenémicos en Enterobacterales es la producción de carbapenemasas que suelen estar asociados a elementos genéticos móviles (EGMs) y que se encargan de vehiculizar y transferir estos genes entre las diferentes especies de Enterobacterales. La situación epidemiológica en España ha ido empeorando en los últimos años. En la actualidad, nuestro país se encuentra en el estadio 4 de la escala epidemiológica europea, lo que significa que, la mayoría de los brotes detectados se han asociado a una transmisión inter-regional. En la mayoría de los hospitales españoles se ha identificado a la carbapenemasa OXA-48 como la más prevalente, la cual se ha asociado con una cepa de Klebsiella pneumoniae ST11, que es considerado un clon de alto riesgo que se ha diseminado por todo el país. Por otro lado, la metalo-β-lactamasa de tipo VIM-1 es la segunda carbapenemasa más frecuente detectada en Enterobacterales y ha dado lugar a brotes esporádicos a lo largo de toda la geografía española, manteniéndose constante en los últimos años. Desde que se detectó el primer caso de Enterobacter cloacae complex con sensibilidad disminuida a los carbapenémicos en el Hospital Universitario 12 de Octubre en 2007, se ha observado un incremento significativo en el aislamiento de diferentes especies de EPC, que afectaron a pacientes ingresados en diferentes servicios clínicos del hospital. Dada la importancia de las carbapenemasas como principal mecanismo de resistencia a carbapenémicos en Enterobacterales, el objetivo principal de esta tesis fue estudiar la epidemiología molecular de los aislamientos de EPC en el Hospital Universitario 12 de Octubre durante un periodo de 10 años de estudio (2007-2017). En el primer estudio se planteó como objetivo estudiar la epidemiología molecular de los aislamientos clínicos de E. cloacae con sensibilidad disminuida a los carbapenémicos durante 2007- 2012. Durante los 6 años de estudio, se detectaron 73 aislamientos de E. cloacae con sensibilidad disminuida a los carbapenémicos, de los cuales, 37 aislamientos fueron portadores de la carbapenemasas VIM-1, 5 aislamientos con KPC-2 y un aislamiento con VIM-2. Entre las características clínicas de los pacientes que sufrieron infecciones/colonizaciones por E. cloacae VIM-1 destacaron que procedían frecuentemente del servicio de Nefrología (43,2%), presentaron como factor de riesgo insuficiencia renal crónica (43,2%), fueron portadores de catéter doble jota (29%) y padecieron con mayor frecuencia infecciones del tracto urinario (51%). Los aislamientos de E. cloacae VIM-1 mostraron una gran diversidad clonal, lo que sugirió que la diseminación de estos aislamientos no dependió de la propagación de un único clon, sino que la diseminación del gen blaVIM-1 estuvo asociada con la transferencia de diferentes EGMs. El gen blaVIM-1 fue identificado en dos tipos de integrones: IntI–blaVIM-1–aacA4–dfrB1–aadA1–catB2–qacEΔ1/sul1 (In624) e IntI–blaVIM-1–aacA4–aadA1–qacEΔ1/sul1 (In488) que, a su vez, se asociaron a un plásmido conjugativo de gran tamaño (300 pb) perteneciente al grupo IncHI2. La secuenciación del genoma completo de la cepa EC_38 confirmó los resultados obtenidos, además de, la detección de otros genes de resistencia a antibióticos que fueron concordantes con el fenotipo de resistencia que estaba expresando dicha cepa. En el segundo estudio el objetivo fue estudiar la epidemiología molecular de los aislamientos clínicos de K. pneumoniae con sensibilidad disminuida a carbapenémicos y que emergieron en el Hospital Universitario 12 de Octubre durante 2009-2014. La carbapenemasa más frecuentemente identificada en la especie de K. pneumoniae fue OXA-48 (61%), seguida de VIM-1 (38%) y KPC-2 (1%). Durante los primeros años se detectaron aislamientos de K. pneumoniae VIM-1 que presentaron una gran diversidad clonal y que fueron causantes de pequeños brotes localizados en servicios clínicos específicos del hospital, como la Unidad de Cuidados intensivos de Neonatología (UCIN) y el servicio de Nefrología. Estos brotes afectaron a pacientes adultos y pediátricos. Cuando se compararon las características de los pacientes colonizados/infectados por K. pneumoniae OXA-48 vs. VIM-1, se observó que los pacientes del primer grupo presentaban una tendencia a haber sido trasladados desde centros sociosanitarios (17,2% vs. 3,4%, p=0,069). Por otra parte, los pacientes colonizados/infectados por K. pneumoniae VIM-1 ingresaron más frecuentemente en el servicio de Nefrología (44,8% vs. 1,8%; p < 0,001), eran más frecuentemente receptores de trasplante de órgano sólido (63,9% vs. 36,4%; p < 0,001) y presentaban con mayor frecuencia infecciones del tracto urinario (51,7% vs. 31,0%; p=0,062). En el año 2013 el escenario epidemiológico policlonal cambio hacia una diseminación clonal por parte del clon ST11 de K. pneumoniae OXA-48, el cual, desplazó a la mayoría de los clones de K. pneumoniae VIM-1. El estudio de tipificación molecular mostró la existencia de 20 patrones clonales que estuvieron circulando durante 2009 a 2014. De entre todos los clones destacó uno de ellos, denominado como clon J, que agrupó a la mayoría de las cepas de K. pneumoniae OXA-48 y que se propagó por todo el hospital persistiendo a día de hoy. Este clon fue identificado como ST11, pertenece al complejo clonal CC258 y es considerado como un clon de alto riesgo. La secuenciación del genoma completo de la cepa K. pneumoniae OXA-48 del clon ST11 reveló la presencia de 121 genes de resistencia a antibióticos, metales y biocidas, además de, una gran variedad de elementos genéticos móviles, entre ellos plásmidos (IncFIB, IncFII, IncL/M e IncR). El gen blaOXA-48 se encontró formando parte del transposón compuesto Tn1999 que, a su vez, se asoció a un plásmido IncL/M, denominado pKPOXA-48J1. Los únicos genes accesorios que estuvieron presentes en este plásmido correspondieron al transposón Tn1999 y al gen blaOXA-48, como único gen de resistencia. En el tercer estudio el objetivo propuesto fue el de investigar los mecanismos implicados en la resistencia a los carbapenémicos y la presencia de EGMs asociados a los aislamientos de C. freundii multirresistentes que fueron detectados en el Hospital Universitario 12 de Octubre durante 2009 a 2014. En los 6 años de estudio se identificó un 2,1% de infecciones/colonizaciones causadas por C. freundii productores de carbapenemasas, siendo VIM-1 la carbapenemasa más prevalente, seguida de KPC-2. En algún caso se detectaron de forma simultánea dos genes de carbapenemasas, blaVIM-1 y blaKPC-2, en el mismo aislamiento. El estudio genómico permitió demostrar que las carbapenemasas detectadas, VIM-1 y KPC-2, estaban localizadas en plásmidos. Se identificaron hasta 7 tipos de replicones (IncFIA, IncFIB, IncFII, IncHI1A, IncHI1B, IncL/M, IncP) siendo el IncL/M el más frecuente. El gen blaVIM-1 estaba asociado con el integrón In624, descrito previamente en nuestro hospital en los aislamientos de E. cloacae VIM-1. Además, 3 de los aislamientos de C. freundii VIM-1 fueron portadores de integrones complejos que se caracterizaron por presentar la secuencia de inserción ISCR1 y genes qnr, que codifican resistencia a quinolonas mediada por plásmidos. La estructura poblacional de los aislamientos de C. freundii productores de carbapenemasas presentó un patrón policlonal. Hubo dos aislamientos, CF_1 (ST89) y CF_4 (ST90), que se encontraron alejados del resto de cepas en el árbol filogenético y que fueron identificadas mediante las herramientas computacionales como Citrobacter portucalensis. Los dos aislamientos de C. portucalensis portadores de VIM-1 y KPC-2, respectivamente, fueron los primeros casos descritos hasta el momento. En el cuarto estudio el objetivo fue estudiar la epidemiología molecular de los aislamientos de E. cloacae complex productores de NDM-7 durante 2016 a 2017. Durante este periodo se detectaron 3 casos de infecciones/colonizaciones por E. cloacae complex con fenotipo de multirresistencia y que portaban la carbapenemasa tipo NDM-7. Los pacientes afectados eran ancianos, presentaron diversas comorbilidades y ninguno de ellos había viajado fuera de España. Los aislamientos clínicos se identificaron inicialmente como E. cloacae complex mediante MALDI-TOF y finalmente como Enterobacter hormaechei mediante la herramienta bioinformática JSpecies. El análisis genómico confirmó la detección de la carbapenemasa NDM-7 y otros genes de resistencia antibiótica que coincidieron con el fenotipo expresado por la cepa. Se identificaron 3 tipos de replicones plasmídicos (IncA/C, IncFIB e IncX3), siendo el plásmido IncX3, denominado pEH-NDM-7-JV, el que albergó el gen blaNDM-7. El entorno genético del gen blaNDM mostró que en el extremo 5´ se localizaba la secuencia de inserción ISAba125 que se encontraba truncada y en el extremo 3’ se encontraba el gen bleMBL. El análisis filogenético reveló que las tres cepas pertenecían al clon ST78 y que estaban estrechamente relacionadas por presentar menos de 75 SNPs de diferencia. Este clon representa a un clon de alto riesgo internacional que se ha identificado en diferentes partes del mundo. En conclusión, esta tesis nos ha permitido estudiar la epidemiología molecular de las EPC más frecuentes en nuestro hospital y conocer los EGMs que albergaron genes de carbapenemasas y que favorecieron su diseminación entre las especies de Enterobacterales. Este estudio pone de manifiesto la problemática en relación a la resistencia a los antimicrobianos, que coincide con la situación epidemiológica actual. Por todo ello, es necesario conocer la epidemiología de cada hospital en relación con las especies y clones circulantes, los tipos de carbapenemasas y EGMs implicados en su diseminación para poder llevar a cabo una intensa vigilancia epidemiológica.