Identificación de nuevas proteínas que interaccionan con los transportadores de glutamato y dopamina (GLT-1 y DAT) mediante alteraciones en sus respectivos entornos

Resumen

El glutamato es el principal neurotransmisor excitador del sistema nervioso central y está involucrado en funciones tales como el aprendizaje o la memoria, y en situaciones patológicas como el ictus o las enfermedades neurodegenerativas. La concentración extracelular de este neurotransmisor se regula por varios transportadores, aunque uno de ellos, GLT-1, es el responsable de la recaptura de más del 90% del glutamato en el cerebro anterior, modulando la transmisión glutamatérgica y evitando de esta manera sus efectos excitotóxicos. La dopamina es otro neurotransmisor y, aunque su distribución es mucho mas restringida que la de glutamato, controla funciones importantes que van desde la actividad motora al comportamiento, la motivación o la recompensa, y está involucrada en patologías tales como la esquizofrenia o la enfermedad de Parkinson. En la sinapsis dopaminérgica el transportador de dopamina, DAT, es el encargado de recapturar este neurotransmisor y devolverlo a los terminales presinápticos. DAT es la diana de drogas de abuso como la cocaína o las anfetaminas, y de fármacos como los antidepresivos tricíclicos. Los transportadores GLT-1 y DAT pertenecen a la superfamilia SLC (Solute Carriers), y aunque difieran en sus estructuras y lugares de expresión, ambos son transportadores activos secundarios acoplados al gradiente electroquímico de iones, especialmente de sodio. Las propiedades de estos transportadores se regulan por modificaciones postraduccionales, así como por proteínas y lípidos que interaccionan con ellos y modulan sus cinéticas y su tráfico intracelular. En esta tesis, con el fin de identificar nuevos componentes de los interactomas de GLT-1 y DAT, se realizaron ensayos de marcaje por proximidad mediante la técnica BioID, que, por la acción del enzima BirA*, marca con biotina las proteínas que residan de manera estable o transitoria en las proximidades de los transportadores, a los que BirA* se había fusionado previamente. Las proteínas marcadas se identificaron mediante espectrometría de masas. De esta manera hemos definido una serie de posibles interactores de GLT-1 (la GTPasa Rac1, el efector de CDC42 CDC42EP4/BORG4 y la subunidad beta de las proteínas G-triméricas asociadas a receptores de membrana GNB4). Entre los potenciales interactores de DAT se encuentra la chaperona 4F2hc (Slc3a2), el receptor de membrana PGMRC2, el proteolípido de la membrana neuronal M6a, la proteína F-Box FBXL2 y la fosfatasa de fosfoinosítidos SHIP2 (Inppl1). Además, se encontró que el canal de potasio Kv7 es capaz de interaccionar tanto con GLT-1 como con DAT. En esta Tesis se han caracterizado algunas de estas interacciones mediante el uso de técnicas de inmunoprecipitación, microscopía confocal, electrofisiología y transporte de sustratos radioactivos. Se ha puesto de manifiesto la importancia para esos transportadores de las interacciones con el citoesqueleto (Rac1, BORG4) y con los fosfolípidos de membrana (SHIP2), así como con los reguladores de los gradientes iónicos (Kv7). El conocimiento de estos interactomas ayuda a comprender el mecanismo de funcionamiento de estos transportadores, de su tráfico intracelular y regulación, y podría proporcionar nuevas dianas de intervención farmacológica para la modulación de sus respectivas actividades