Análisis de mutaciones KRAS en el ADN de muestras fecales extraídas de pacientes con cáncer colorrectal

Resumen

INTRODUCCIÓN. Actualmente, el cáncer colorrectal (CCR) continúa mostrando unos altos índices de incidencia en todo el mundo. La evolución en sistemas de cribado halogrado establecer diagnósticos en etapas precoces de la enfermedad, cuando casi la mayoría de los protocolos de tratamiento son exitosos, consiguiendo una mejoría en la supervivencia global (SG) de los pacientes. En el manejo clínico y terapéutico del CCR se requiere del análisis de biomarcadores moleculares, como las mutaciones KRAS o BRAF, las cuales están asociadas con la aparición de resistencia a la terapia con agentes biológicos. El genotipado tumoral generalmente se realiza utilizando el acido desoxirribonucleico (ADN) extraído de biopsias de tejido fijado con formalina y embebido en parafina (FFPE), aunque en los últimos años se han realizado estudios sobre el ADN libre obtenido de muestras sanguíneas. En etapas tempranas de la enfermedad, los niveles de copias mutadas del ADN circulante (ADNc) pueden ser, en algunos casos, demasiado bajos para su detección. Por lo tanto, es necesario métodos alternativos extremadamente sensibles y no invasivos para mejorar la detección y lograr una cuantificación precisa de estos biomarcadores. Las muestras fecales son una fuente alternativa y no invasiva de material genético para el genotipado de lesiones tumorales en el CCR. Hasta la fecha, se han propuesto varias estrategias basadas en el análisis de marcadores moleculares en muestras fecales, aunque su aplicación en la práctica clínica sigue siendo limitada debido a su costo elevado y sensibilidad reducida en etapas tempranas de la enfermedad. OBJETIVOS. El objetivo principal de este estudio fue evaluar el potencial diagnóstico de la PCR digital (ddPCR) para detectar la mutación KRASG12D en el ADN obtenido de muestras fecales de pacientes con CCR, como prueba de concepto de la aplicabilidad de esta tecnología como método no invasivo para el estudio de biomarcadores clínicamente relevantes asociados al ADN de muestras fecales. MÉTODOS. Fue necesario el desarrollo de una metodología adecuada para la obtención de ADN humano, desde muestras fecales de pacientes con CCR, en una cantidad y calidad aceptables para su estudio. Una vez obtenido dichas muestras de ADN y utilizando la tecnología ddPCR se detectó la mutación KRASG12D, comparando posteriormente dichos resultados con la técnica de pirosecuenciación, la cual se utiliza de forma estándar en la actualidad para la detección de mutaciones en tejido tumoral FFPE. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Se recolectó e incluyó en el estudio las muestras de tejido tumoral FFPE y muestras fecales de un total de 70 pacientes con CCR. Se dividieron los subgrupos según la localización del tumor primario: 26 en colon DERECHO (37,2%), 36 en colon IZQUIERDO (51,4%) y 8 en RECTO (11,4%). Del total, se detectó mediante pirosecuenciación la mutación del gen KRAS en 33 muestras de tejido tumoral FFPE (47,1%) y 37 fueron catalogadas como KRAS wild-type (52,9%). La mutación KRASG12D establecida previamente mediante pirosecuenciación fue detectada mediante la tecnología de ddPCR en el ADN derivado del tumor FFPE en el 100% de los casos y en el 80% del ADN derivado de muestras fecales de pacientes con CCR. La tecnología ddPCR, que ha mejorado la sensibilidad en la detección de mutaciones de alelos minoritarios en bajas concentraciones de ADN a partir de fluidos biológicos, como plasma y orina, se basa en reacciones de amplificación de hasta diez mil gotas microscópicas en una escala de nanolitros, logrando la amplificación por PCR de las moléculas contenidas en cada gota. En el campo de la Oncología, el análisis de fluidos biológicos está ganando un interés creciente como una herramienta no invasiva y predictiva de gran valor clínico para controlar la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento haciendo innecesarias las biopsias en serie. Este es el primer estudio que describe la detección de la mutación KRASG12D en el ADN derivado de heces de pacientes con CCR utilizando una plataforma de ddPCR disponible en el mercado, incluso en individuos con etapas tempranas de la enfermedad. ddPCR sirvió como una herramienta confiable para detectar esta mutación clínicamente relevante en el ADN derivado de heces de pacientes con CCR. Se han investigado varias estrategias basadas en heces que involucran PCR digital para analizar mutaciones relevantes para el manejo del CCR. Sin embargo, ninguno de estos enfoques ha sido desarrollado y sometido a validación clínica para la detección de ADN en heces hasta la fecha. Las ventajas de la tecnología ddPCR, junto con la instrumentación y los protocolos que puede adoptar cualquier laboratorio, respaldan una posible traducción de este enfoque a los escenarios clínicos. Nuestros resultados muestran que la detección de la mutación KRASG12D en el ADN derivado de heces por ddPCR es un enfoque rápido, simple y asequible que podría adaptarse para detectar otros biomarcadores moleculares clínicamente relevantes para el manejo del CCR. A la luz de nuestros resultados, se podría proponer que el análisis de biomarcadores por ddPCR en muestras de heces puede complementar los métodos actuales de detección de CCR. CONCLUSIONES. El método preoperatorio desarrollado en este estudio permite la obtención de ADN humano a partir de muestras fecales de pacientes diagnosticados de CCR en una concentración y pureza suficientes para su análisis mediante ddPCR. La detección de la mutación G12D del gen KRAS mediante ddPCR en el ADN obtenido a partir de tejido tumoral FFPE es eficaz y equiparable con los resultados obtenidos mediante pirosecuenciación. Esta mutación tuvo una incidencia mayoritaria en los pacientes incluidos en nuestro grupo de estudio. Por otro lado, la detección de la mutación G12D del gen KRAS mediante ddPCR en el ADN obtenido a partir de muestras fecales de pacientes con CCR es factible y reproducible y en la mayor parte de los casos es comparable con la técnica de pirosecuenciación. La mutación del gen KRAS, la cual se indentificó en su mayoría de los casos en tumores localizados en colon izquierdo, se asoció a una menor supervivencia libre de enfermedad en el segumiento clínico postoperatorio en los pacientes estudiados. INTRODUCTION. Nowadays, colorectal cancer (CRC) continues to show very high rates of incidence throughout the world. The evolution in screening systems has managed to establish diagnoses in early stages of the disease, when almost the majority of treatment protocols are successful, achieving an improvement in the overall survival (OS) of patients. CRC clinical and therapeutic management requires the analysis of molecular biomarkers, such as KRAS or BRAF mutations, which are associated to biological therapy resistance. Generally, tumor genotyping is performed using deoxyribonucleic acid (DNA) extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue (FFPE), although studies on free DNA obtained from blood samples have been conducted in recent years. On early stages of the disease, levels of mutated copies of circulating DNA (cDNA) may be too low to be detection. Therefore, is necessary to find alternative sensible and non-invasive methods to improve screening and precise detection of these biomarkers. Stool samples are a non-invasive alternative for genotyping of tumor lesions in the CRC. To date, several strategies have been proposed based on the analysis of molecular markers in stool samples but have a limited use in clinical practice due to its elevated cost and low sensibility at early stages of the disease. OBJETIVES. The main objective of this study was to evaluate the diagnostic potential of digital PCR (ddPCR) to detect the KRASG12D mutation in the DNA obtained from fecal samples from patients with CRC, as proof of concept of the applicability of this technology as a non-invasive method for the study of clinically relevant biomarkers associated with DNA from stool samples. METHODS. It was necessary to develop a suitable methodology for obtaining human DNA from stool samples, in an acceptable quantity and quality for their study. Once these DNA samples were obtained and using the ddPCR technology, the KRASG12D mutation was detected. Later, we compared our results with those obtained with the pyrosequencing technique, which is the standard to detect mutations on tumoral tissue. RESULTS AND DISCUSSION. We obtained tumoral tiusse processed with FFPE and stool samples from 70 CRC. They were divided into subgroups according to localization of the primary tumor: 26 in the right colon (37.2%), 36 on left colon (51.4%) and 8 on the rectum (11.4%). Using pyrosequencing technique, we detected KRAS on 33 samples of FFPE tumoral tissue (47.1%) and 37 were catalogued as KRAS wild-type (52.9%). KRASG12D mutation previously stablished by pyrosequencing was detected on the DNA derived from the FFPE tumor tissue in 100% of the cases and in 80% of the DNA derived from stool samples using ddPCR technology. The ddPCR technology has improved sensibility on the detection of minority alleles mutations on low concentrations of DNA obtained from biological fluids, such as plasma or urine, is based on amplification reactions of up to ten thousand microscopic droplets on a nanoliter scale , achieving the amplification by PCR of the molecules contained in each drop. In the field of Oncology, the analysis of biological fluids is gaining increasing interest as a non-invasive and predictive tool of great clinical value to control the progression of the disease and its response to treatment, making biopsies unnecessary. This is the first study that describes the detection of KRASG12D mutation in the DNA derived from stool samples of CRC patients using the ddPCR platform available on the market. ddPCR was useful and reliable, even on patients at early stages of the disease. There are some other techniques based on the analysis of stool samples involving digital PCR to detect mutations, but there hasn´t been fully developed or validated. Our results show that detection of the mutation KRASG12D on DNA taken from stool samples, is a fast, simple and accesible approach, that could be adapt in order to detect clinically relevant biomarkers in the management of CRC. In light of our results, it could be suggesting that ddPCR on stool samples could complement current methods of detection of CRC. CONCLUSIONS. The method used in this study, allows the collection of human DNA from stool samples of CRC patients, on a concentration and purity sufficient enough to make its ddPCR analysis possible. The G12D mutation from KRAS gen, detected on DNA from FFPE tumoral tissue procesed by pyrosequencing technique, has a predominant incidence on CRC patients included on our study. On the other hand, detection of G12D mutation through ddPCR on DNA obtained from stool samples from CRC patients, is feasible and replicable. Plus, in most of cases, it is comparable with the pyrosequencing technique. Mutation of the KRAS gene, which was identified in the majority of cases in tumors located in the left colon, was associated with a lower disease-free survival in the postoperative clinical follow-up in the patients studied.