Caracterización genética y funcional del sistema microcina MccH47/MccM en el probiótico Escherichia coli Nissle 1917

Resumen

1. INTRODUCCIÓN. 1 1.1 PROBIÓTICOS. 3 1.1.1 Presencia en el hospedador diana por adhesión a su epitelio intestinal. 3 1.1.2 Ausencia de patogenicidad. 4 1.1.3 Resistencia a las condiciones del aparato digestivo. 4 1.1.4 Capacidad de resistencia a los procesos tecnológicos. 5 1.1.5 Viabilidad durante toda la vida útil del producto. 5 1.1.6 Evidencia científica de los efectos beneficiosos específicos en estudios clínicos correctamente diseñados. 6 1.2 LA CEPA Escherichia coli NISSLE 1917 8 1.2.1 La cepa Nissle 1917 como probiótico. 9 1.2.2 Evidencias científicas que justifican la utilización de E. coli Nissle 1917. 10 1.2.3 Características más relevantes de de la cepa Nissle 1917. 11 1.3 LAS MICROCINAS. 13 1.3.1 Moduladores de los nichos ecológicos. 13 1.3.2 Definición de microcina. 13 1.3.3 Clasificación. 14 1.3.4 Aplicaciones de las microcinas. 16 1.4 SIDERÓFOROS. 17 1.4.1 Enterobactina. 17 1.4.2 Salmoquelina. 19 2. OBJETIVOS. 21 3. MATERIALES Y MÉTODOS. 25 3.1 ESTIRPES BACTERIANAS, PLÁSMIDOS Y BACTERIÓFAGOS. 27 3.2 MEDIOS DE CULTIVO. 28 3.3 ANTIBIÓTICOS E INDICADORES. 28 3.4 OLIGONUCLEÓTIDOS CEBADORES. 28 3.5 SOLUCIONES Y TAMPONES. 30 3.6 MÉTODOS. 31 3.6.1 Clonaje de regiones cromosómicas in vivo: El fago Mu. 31 3.6.2 Obtención de lisados de los bacteriófagos mini-MudII4042 y mini-Mud5005. 32 3.6.3 Aislamiento de los plásmidos mini-MudII4042 que recuperan el fenotipo productor de microcinas. 32 Índice xx 3.6.4 Aislamiento de mutantes no productores de microcina por medio de mutagénesis con transposones mini-Tn5. 32 3.6.5 Test de producción de microcina. 33 3.6.6 Test de inmunidad a la microcina. 33 3.6.7 Manipulaciones de DNA. 34 3.6.8 Test de complementación. 34 3.6.9 Clonación de genes por PCR 34 3.6.10 Secuenciación de los fragmentos de PCR. 34 3.6.11 Método de la PCR Vectorette. 35 4. RESULTADOS. 37 4.1 CARACTERIZACIÓN DE LA CEPA E. coli NISSLE 1917. 39 4.2. SISTEMA MICROCINA. 40 4.2.1 Intento de clonación del sistema microcina mediante el método de clonación in vivo empleando mini-Mu. 40 4.2.2 Inserciones con mini-MudII1681: mutante MFH20 40 4.2.3 Obtención de mutantes no productores de Microcina M mediante Inserciones mini-Tn5. 42 4.2.4 Obtención de fragmentos cromosómicos de Nissle 1917 capaces de restaurar la capacidad de producir microcina M en los mutantes aislados previamente. 44 4.2.5 Derivados del plásmido pRH7.1. 45 4.2.6 Secuenciación de la región clonada en el plásmido pRH7.1. 48 4.2.7 Comparación entre pRH7.1 y pEX4. 49 4.2.8 Nissle 1917 produce dos microcinas: MccH47 y MccM. 52 4.2.9 Secuencia del derivado pEX5 y pEX101. 55 Índice xxi 4.2.10 El gen mchA es necesario para la producción de MccH47 y MccM. 55 4.2.11 Clonación de mchA. 56 4.2.12 Construcción del plásmido híbrido pHM1. 56 4.2.13 Genes de inmunidad específica y precursor de microcina M (mcmI y mcmA). 58 4.2.14 Genes de inmunidad específica y precursor de microcina H47 (mchI y mchB). 60 4.2.15 Mutagénesis sobre el plásmido híbrido. 62 4.2.16 Búsqueda del homólogo a mchA en el genoma de Mutaflor. 63 4.2.17 Clonación del homólogo a mchA. 64 4.2.18 Secuencia del plásmido pMM30. 65 4.3 DESCRIPCIÓN DE LOS GENES. 66 4.3.1 Gen precursor de la microcina M: mcmA. 66 4.3.2 Gen específico de inmunidad a microcina M: mcmI. 67 4.3.3 Gen precursor de la microcina H47: mchB 68 4.3.4 Gen de inmunidad de la microcina H47: mchI. 69 4.3.5 El gen mchX: Un gen de función desconocida. 70 4.3.6 Genes mchC y mchD: sistema de maduración. 71 4.3.7 Genes de transporte: mchE y mchF. 71 4.3.8 Los genes mchA y mcmG: codifican glicosiltransferasas. 72 4.3.9 Gene mchS: Enteroquelinesterasa. 74 4.3.10 Diferencias a la izquierda de mchX entre pEX4 y pRH7.1. 75 4.3.11 Diferencias a la derecha de mchF entre pEX4 y pRH7.1. 76 4.4 OTROS GENES FUERA DEL SISTEMA MICROCINA IMPLICADOS EN LA PRODUCCIÓN DE MICROCINA Y/O EN LA ESTABILIDAD DE LAS CEPAS PRODUCTORAS. 80 4.4.1 Mutación FinZ. 80 4.4.2. Mutación TolC. 81 Índice xxii 5. DISCUSIÓN. 83 5.1 MICROCINAS. 85 5.1.1 Un sistema genético compartido. 85 5.1.2 Sistema de secreción. 87 5.1.3 Genes estructurales de MccH47 y MccM. 88 5.1.4 Genes de inmunidad. 90 5.1.5 McmM y McmT. 92 5.1.6 Genes de modificación: 1) mcmG, 2) mchS, 3) mchC y 4) mchD. 93 5.1.7 Otros Genes implicados. 95 5.1.8 Comparación con el genoma de E. coli O157:H7. 95 5.1.9 Modelo propuesto de la síntesis, modificación y exportación de MccM y MccH47 96 5.2 ADDENDUM A LA DISCUSIÓN. 98 5.2.1 El mapa genómico de la cepa E. coli Nissle 1917. 98 5.2.2 Resumen esquemático de los factores de adaptación en E. coli Nissle 1917. 101