Characterization of the biological activity of pru p 3 in plant and intestinal epithelium

Resum

La alergia es un problema social que supone una grave disminución de la calidad de vida del paciente, estando considerada como la mayor enfermedad crónica en Europa en la actualidad. Desde mediados del siglo XX, se ha producido un incremento en la prevalencia de esta enfermedad aunque el origen de este incremento es todavía desconocido. Para prevenir y tratar este tipo de enfermedades es necesario conocer el mecanismo por el cual una proteína se convierte en alergénica. El objetivo principal de esta Tesis ha sido estudiar los mecanismos moleculares que están implicados en los procesos de sensibilización alérgica. Evidencias crecientes sugieren que los lípidos transportados por determinados alérgenos pueden ser reconocidos por receptores celulares del sistema inmune, pudiendo tener un papel destacado en la sensibilización alérgica. En este trabajo se ha escogido como modelo Pru p 3, alérgeno principal del melocotón y proteína transportadora de lípidos, (lipid transfer protein, LTP). El ligando lipídico de Pru p 3 se ha caracterizado estructuralmente por primera vez empleando ESI-micrOTOF-QII. Así, el ligando se ha identificado como un derivado hidroxilado de camptotecina unida a fitoesfingosina, segmento que forma una cola hidrocarbonada que se inserta en el túnel hidrofóbico de la proteína. La naturaleza química del ligando ha sido confirmada mediante ensayos de inhibición de la topoisomerasa I y emisión de fluorescencia a 254 nm, ambas características típicas de la camptotecina. Por otra parte, combinando diferentes técnicas in vitro (como RT-PCR e inmunohistoquímica), se ha caracterizado el posible papel del ligando en planta. La máxima expresión de Pru p 3 se detectó en los estilos de flores polinizadas, en contraste con su ausencia en no polinizados donde su expresión disminuye tras la antítesis. Además, la mayor expresión de Pru p 3 se localizó en piel, más concretamente en los tricomas, pero no en la pulpa. Estos datos, junto con la inhibición de la germinación del polen por parte del ligando, sugieren que Pru p 3 puede inhibir una segunda polinización y mantener alejados los herbívoros hasta la maduración de la semilla. Igualmente, se ha evaluado la actividad inmunológica del ligando lipídico empleando diferentes modelos in vitro (como moDC, PBMCs, THP1 y células epiteliales como Caco2) y un modelo de ratón de anafilaxia. Así se ha determinado que el ligando es capaz de modular el sistema inmune a través de una respuesta Th2, siendo el responsable de la activación de las células presentadoras de antígeno y aumenta la capacidad de sensibilización alérgica a Pru p 3 en el modelo de ratón. Además, el ligando es presentado por el receptor CD1d en las células epiteliales, activando a continuación las células iNKT. Estos resultados se han confirmado con un empleo del modelo ex vivo InTESTineTM con fragmentos de tejido de cerdo. De este modo se ha podido observar que el ligando no afecta al transporte de Pru p 3 a través de la barrera intestinal aunque parece que Pru p 3 queda acumulado en las Placas de Peyer. Por otra parte, se ha observado que la presencia del ligando induce la expresión de citoquinas típicas de una respuesta Th2 como IL4 e IL13. Igualmente se ha confirmado que Pru p 3 co-localiza con el receptor CD1d en presencia del ligando y que aumenta la presencia de células iNKT. En resumen, este trabajo representa un nuevo enfoque sobre los mecanismos que caracterizan la alergia, aportando resultados de gran utilidad tanto para la mejora del diagnóstico como para nuevas investigaciones sobre esta enfermedad.